Muitas doenças são causadas pela ausência ou defeito de uma cópia de um único gene. Há décadas, cientistas trabalham em tratamentos de terapia genética que poderiam curar essas doenças, fornecendo uma nova cópia dos genes ausentes às células afetadas. Apesar desses esforços, pouquíssimos tratamentos de terapia genética foram aprovados pela FDA, que é a agência federal americana responsável por proteger a saúde pública, assegurando a segurança, eficácia e segurança de medicamentos, produtos biológicos, dispositivos médicos, alimentos, cosméticos e produtos que emitem radiação. Um dos desafios para o desenvolvimento desses tratamentos tem sido controlar a expressão do novo gene nas células — se for muito pouco, não terá sucesso; se for muito, pode causar efeitos colaterais graves.
Para ajudar a alcançar um controle mais preciso da terapia genética, engenheiros do MIT ajustaram e aplicaram um circuito de controle capaz de manter os níveis de expressão dentro de uma faixa-alvo. Em células humanas, eles demonstraram que poderiam usar esse método para introduzir genes que poderiam ajudar a tratar doenças como a síndrome do X frágil, um distúrbio que leva à deficiência intelectual e outros problemas de desenvolvimento. “Em teoria, a suplementação genética pode resolver distúrbios monogênicos que são muito diversos, mas que podem ser resolvidos por meio de terapia genética relativamente simples, se você puder controlar a terapia bem o suficiente”, afirma Katie Galloway, professora de desenvolvimento de carreira da WM Keck em Engenharia Biomédica e Engenharia Química e autora sênior do novo estudo.
A estudante de pós-graduação do MIT, Kasey Love, é a autora principal do artigo, publicado hoje na Cell Systems . Outros autores do artigo incluem os estudantes de pós-graduação do MIT, Christopher Johnstone, Emma Peterman e Stephanie Gaglione, e Michael Birnbaum, professor associado de engenharia biológica do MIT. A pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais, pela Fundação Nacional de Ciências, pelo Instituto de Biotecnologias Colaborativas e pelo Laboratório de Pesquisa da Força Aérea.
Embora a terapia genética seja promissora para o tratamento de uma variedade de doenças, incluindo hemofilia e anemia falciforme, apenas alguns tratamentos foram aprovados até agora para uma doença hereditária da retina e certos tipos de câncer no sangue. A maioria das abordagens de terapia genética utiliza um vírus para introduzir uma nova cópia de um gene, que é então integrada ao DNA das células hospedeiras. Algumas células podem absorver muitas cópias do gene, enquanto outras não recebem nenhuma.
“A simples superexpressão dessa carga útil pode resultar em uma gama muito ampla de níveis de expressão nos genes-alvo, pois eles ocupam diferentes números de cópias desses genes ou simplesmente apresentam diferentes níveis de expressão”, diz Love. “Se não estiver se expressando o suficiente, isso anula o propósito da terapia. Mas, por outro lado, expressar em níveis muito altos também é um problema, pois essa carga útil pode ser tóxica.”
Para tentar superar isso, cientistas experimentaram diferentes tipos de circuitos de controle que restringem a expressão do gene terapêutico. Neste estudo, a equipe do MIT decidiu usar um tipo de circuito chamado circuito de alimentação direta incoerente (IFFL). Em um circuito IFFL, a ativação do gene alvo ativa simultaneamente a produção de uma molécula que suprime a expressão gênica. Um tipo de molécula que pode ser usada para atingir essa supressão é o microRNA — uma sequência curta de RNA que se liga ao RNA mensageiro, impedindo sua tradução em proteína.
Neste estudo, a equipe do MIT projetou um circuito IFFL, denominado “ComMAND” (atenuador compacto de ruído e dosagem mediado por microRNA), de modo que uma fita de microRNA que reprime a tradução do mRNA seja codificada dentro do gene terapêutico. O microRNA está localizado em um pequeno segmento chamado íntron, que é separado do gene quando transcrito em mRNA. Isso significa que, sempre que o gene é ativado, tanto o mRNA quanto o microRNA que o reprime são produzidos em quantidades aproximadamente iguais.
Essa abordagem permite que os pesquisadores controlem todo o circuito ComMAND com apenas um promotor — o sítio do DNA onde a transcrição gênica é ativada. Ao trocar promotores de diferentes intensidades, os pesquisadores podem ajustar a quantidade do gene terapêutico que será produzida. Além de oferecer um controle mais rigoroso, o design compacto do circuito permite que ele seja transportado em um único veículo de entrega, como um lentivírus ou um vírus adeno-associado, o que pode melhorar a capacidade de fabricação dessas terapias. Ambos os vírus são frequentemente usados para entregar cargas terapêuticas. “Outras pessoas desenvolveram circuitos de transmissão incoerentes baseados em microRNA, mas o que Kasey fez foi colocar tudo em uma única transcrição, e ela mostrou que isso proporciona o melhor controle possível quando há entrega variável às células”, diz Galloway.
Controle preciso
Para demonstrar esse sistema, os pesquisadores projetaram circuitos ComMAND capazes de transportar o gene FXN, que sofre mutação na ataxia de Friedreich — um distúrbio que afeta o coração e o sistema nervoso. Eles também transportaram o gene Fmr1, cuja disfunção causa a síndrome do X frágil. Em testes com células humanas, eles demonstraram que conseguiam ajustar os níveis de expressão gênica para cerca de oito vezes os níveis normalmente observados em células saudáveis.
Sem o ComMAND, a expressão genética era mais de 50 vezes superior ao nível normal, o que poderia representar riscos à segurança. Mais testes em modelos animais seriam necessários para determinar os níveis ideais, afirmam os pesquisadores. Os pesquisadores também realizaram testes em neurônios de ratos, fibroblastos de camundongos e células T humanas. Para essas células, eles introduziram um gene que codifica uma proteína fluorescente, permitindo medir facilmente os níveis de expressão gênica. Nessas células, os pesquisadores também descobriram que conseguiam controlar os níveis de expressão gênica com mais precisão do que sem o circuito.
Os pesquisadores agora planejam estudar se poderiam usar essa abordagem para fornecer genes em um nível que restauraria a função normal e reverteria os sinais da doença, seja em células cultivadas ou em modelos animais. “Provavelmente seria necessário fazer algum ajuste nos níveis de expressão, mas entendemos alguns desses princípios de design, então, se precisássemos ajustar os níveis para cima ou para baixo, acho que saberíamos como fazer isso”, diz Love.
Essa mesma abordagem poderia ser aplicada a outras doenças como a síndrome de Rett, distrofia muscular e atrofia muscular espinhal, dizem os pesquisadores. “O desafio com muitas dessas doenças é que também são raras, então não há grandes populações de pacientes”, diz Galloway. “Estamos tentando desenvolver ferramentas robustas para que as pessoas possam descobrir como fazer o ajuste, porque as populações de pacientes são muito pequenas e não há muito financiamento para resolver alguns desses transtornos.”
